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Inde: de l’urine de vache pour se protéger du coronavirus | AFP News

Nous avons étudié la cinétique des titres d’anticorps neutralisants et de pointe de coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) au cours d’une année chez 11 patients qui ont été confirmés par PCR par transcription inverse comme ayant été infectés lors de l’épidémie en Corée du Sud en 2015 Des réponses solides en anticorps ont été détectées chez tous les survivants atteints d’une maladie grave; les réponses sont restées détectables, quoique avec un certain déclin, pendant 1 an. La durée de détection de l’ARN viral (mais pas la charge virale) dans les expectorations était significativement corrélée à l’ampleur de la réponse des anticorps. Les titres d’anticorps MERS S1 ELISA étaient bien corrélés avec la réponse en anticorps neutralisants. Les titres d’anticorps chez 4 des 6 patients qui avaient une maladie bénigne étaient indétectables même si la plupart avaient des signes de pneumonie. Cette constatation implique que les études séroépidémiologiques MERS-CoV sous-estiment nettement l’étendue de l’infection bénigne et asymptomatique. L’obtention de plasma en phase de convalescence avec des titres élevés d’anticorps pour traiter le MERS sera difficile.

Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) reste une maladie préoccupante pour la santé publique mondiale pour laquelle aucune contre-mesure spécifique prouvée n’est disponible. Au 5 décembre 2016,,81 800 cas confirmés en laboratoire avaient été signalés (1). Le coronavirus MERS (MERS-CoV) est un pathogène enzootique présent dans les chameaux dromadaires dans de nombreuses régions du monde, notamment au Moyen-Orient, en Iran, au Pakistan et en Afrique (2,3). Des infections zoonotiques ont été signalées à plusieurs reprises dans la péninsule arabique et ont provoqué de grandes flambées nosocomiales. Un exemple notable s’est produit en Corée du Sud en 2015, à l’initiative d’un voyageur revenant de la péninsule arabique (4). L’infection chez ce voyageur a provoqué une épidémie de 186 cas et 36 décès qui ont eu un impact substantiel sur l’économie locale. Une cohorte de 17 patients de cette éclosion a fait l’objet d’un suivi intensif pour obtenir une caractérisation clinique, immunologique et virologique détaillée de l’évolution de leur maladie (5,6). La cinétique des réponses sérologiques au cours de la phase aiguë a déjà été rapportée et a montré que des réponses en anticorps robustes mais différées pouvaient être détectées chez des patients plus gravement malades (7). Une autre étude a signalé une corrélation linéaire significative entre le log₁₀ les charges virales et la réponse sérologique dans la phase aiguë de la maladie (8). La cinétique des réponses sérologiques à long terme aux infections à MERS-CoV est mal connue et reste d’intérêt clinique. Nous rapportons les résultats d’un suivi d’un an sur les réponses en anticorps chez 11 de ces patients.

Matériel et méthodes

Les patients

Les réponses sérologiques en phase aiguë d’une cohorte de 17 patients atteints de MERS-CoV confirmée par PCR à transcription inverse (RT-PCR), admis à l’hôpital de l’Université nationale de Séoul (SNU) à Séoul, Corée du Sud; SNU Boramae Medical Center à Séoul; et l’hôpital SNU Bundang de Seongnam, en Corée du Sud, avaient déjà été signalés (7). Neuf de ces patients avaient une maladie grave (définie comme nécessitant un apport supplémentaire d’oxygène ou une ventilation mécanique). Les profils clinique, de charge virale et de cytokines avaient été précédemment rapportés (5,6).

Nous avons suivi 11 de ces patients, 5 atteints d’une maladie grave (patients C, D, F, G et I) et 6 atteints d’une maladie légère (patients K, L, M, N, O et P), pendant 1 an. Leurs échantillons de sérum ont été prélevés ≈6 mois et ≈12 mois après le début de la maladie et utilisés pour étudier la cinétique à long terme et la durée des réponses en anticorps qui forment la base de ce rapport. Les caractéristiques cliniques et les réponses immunologiques précoces des cohortes originales et actuelles de patients sont résumées (annexe technique, tableau 1). Les raisons du manque de suivi pour les 6 autres patients étaient le transfert des soins vers une autre unité clinique (patient A), le refus de suivi (patients J et Q) et le décès (patients B, E et H). Les patients B et E sont décédés pendant la phase aiguë de la maladie, et le patient H a reçu son congé pour recevoir des soins de réadaptation, mais a ensuite reçu un diagnostic de pneumonie par aspiration et est décédé 2 mois après le début de la maladie. Cette étude a été approuvée par l’Institutional Ethics Review Board du Seoul National University Hospital (approbation no 1506-093-681).

Virus

La souche humaine CoV-EMC / 2012 a été utilisée pour des dosages infectieux à 50% en culture tissulaire, des dosages de microneutralisation et des tests de neutralisation par réduction de plaque (PRNT). Un sous-ensemble d’échantillons de sérum a également été testé avec une souche de l’épidémie en Corée du Sud, MERS-CoV Hu / KOR / SNU1_035 / 2015.

Tests sérologiques

Nous chauffons des échantillons de sérum inactivé pendant 30 min à 56 ° C avant d’effectuer des tests sérologiques. Nous avons effectué le MERS-CoV PRNT (en utilisant un seuil de réduction de la plaque> 90% [PRNT₉₀]), test de microneutralisation et test de neutralisation des pseudoparticules (ppNT) comme décrit (7,9) (Annexe technique en ligne).

Nous avons utilisé le kit ELISA MERS-CoV S1 (EI 2604-9601G; EUROIMMUN, Luebeck, Allemagne) pour la détection des IgG humaines contre la protéine de pointe MERS-CoV. Nous avons analysé les échantillons de sérum en double et effectué le test conformément aux instructions du fabricant. Le test comprenait un calibrateur, qui définit la limite supérieure de la plage de référence pour les humains non infectés, et cette limite supérieure a servi de valeur seuil. Le dosage a été rendu semi-quantitatif en calculant le rapport de l’extinction de l’échantillon de patient sur l’extinction du calibrateur. Des ratios> 1,1 ont été jugés positifs et des ratios> 0,8 à

Figure. Titres d’anticorps contre le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) dans des échantillons de sérum collectés en série de 11 patients atteints de MERS symptomatique confirmé par PCR à transcription inverse, Corée du Sud, 2015. PRNT₉₀ titres (A) et pointe MERS.

Les 5 patients atteints d’une maladie grave, mais seulement 2 (33%) des 6 atteints d’une maladie légère (p = 0,06 selon le test exact de Fisher), avaient un PRNT₉₀ titres d’anticorps> 40 au recul d’un an (figure, partie A). PRNT₉₀ les titres d’anticorps des patients C et F, qui avaient des titres d’anticorps en phase aiguë> 320, ont diminué> 4 fois 1 an plus tard. Les patients D, G, K et N qui avaient des titres d’anticorps de pointe en phase aiguë dans la plage de 80 à 160 n’avaient que deux fois plus de titres. Patients C, D, F, G, I, K et N (les 5 patients atteints d’une maladie grave et 2 des 6 atteints d’une maladie bénigne qui avaient une PRNT₉₀ des titres d’anticorps> 40 dans leurs échantillons de sérum en phase aiguë [collectés 21–50 jours après le début de la maladie]) ont continué à contenir des anticorps détectables par PRNT₉₀ (titre> 1:40), ppNT (titre> 1:40), test de microneutralisation (titre> 1:20) et S1 ELISA (ratio> 1,1) 1 an après le début de la maladie (tableau; figure, panneau B). Les titres d’anticorps MERS ont diminué au cours des 6 premiers mois après le début de la maladie, en particulier chez les patients qui avaient des titres élevés d’anticorps. Le déclin des titres d’anticorps entre 6 mois et 1 an après le début de la maladie a été moins prononcé.

À 1 an après l’infection, les 4 patients qui avaient une maladie bénigne (ou qui n’avaient pas besoin d’oxygène supplémentaire ou de ventilation mécanique) avaient tous des résultats négatifs par test de microneutralisation et S1 ELISA, mais 1 était positif par ppNT (titre de 10) et 2 par PRNT₉₀ (titre 1:10) (tableau). Bien que désignés comme ayant une maladie bénigne, tous ces patients, à une exception près (patient P), ont eu des infiltrats thoraciques aux rayons X, indiquant une pathologie parenchymateuse pulmonaire.

La cinétique de production d’anticorps vue avec le PRNT₉₀, ppNT, test de microneutralisation et S1 ELISA étaient comparables (tableau), suggérant que n’importe lequel de ces tests pourrait être utilisé pour la détection des anticorps MERS-CoV chez les patients ayant une infection passée. Un an après l’infection, tous les patients qui avaient des titres d’anticorps> 20 par PRNT₉₀ avait également des anticorps détectables par ppNT, test de microneutralisation et S1 ELISA. Un patient (L) avec un PRNT marginal₉₀ le titre de 1:10 n’était pas positif par ppNT, test de microneutralisation ou ELISA. 1 an après l’infection, les coefficients de corrélation étaient de 0,89 entre PRNT₉₀ et titres ppNT, 0,94 entre PRNT₉₀ et les titres des tests de microneutralisation, et 0,96 entre le PRNT₉₀ et titres ELISA S1.

Le virus que nous avons utilisé pour les tests sérologiques était le prototype du virus MERS-CoV EMC clade A, et le virus auquel les patients étaient exposés (et qui a provoqué l’épidémie en Corée du Sud) était un virus clade B. Pour confirmer que les titres d’anticorps neutralisants contre les virus du clade A et B n’étaient pas significativement différents, nous avons testé 10 échantillons de sérum appariés (provenant de 5 patients MERS-CoV qui avaient différents niveaux de réponses d’anticorps de microneutralisation à la CEM) par test de microneutralisation en utilisant le clade A et un virus clade B de l’épidémie en Corée du Sud. Les titres étaient similaires (dans une dilution 2 fois), confirmant que les épitopes neutralisants de MERS-CoV sont conservés de manière antigénique (annexe technique, tableau 2).

Les charges virales maximales dans les expectorations n’étaient pas corrélées avec le PRNT₉₀ titres d’anticorps ou rapports OD ELISA S1 à la phase aiguë de la maladie, à environ 6 mois après la maladie ou à environ 12 mois après la maladie (annexe technique, tableau 3). Cependant, nous avons trouvé de fortes corrélations positives entre la durée de détection du virus et les titres d’anticorps (mesurés par le PRNT₉₀ et S1 ELISA) à ces moments (tableau 4 de l’annexe technique). Nous avons défini la durée de détection du virus comme le jour entre l’apparition des symptômes et la conversion PCR négative. La durée médiane de l’excrétion du virus était de 19 jours (intervalle interquartile 16,5-27,5 jours). Seuls 2 des patients (D et F) ont reçu une corticothérapie, et les deux ont eu des réponses anticorps robustes (tableau). Cependant, en raison du petit nombre de patients recevant ce traitement, il n’a pas été possible d’évaluer sa qualité avec une analyse statistique.

Discussion

Avec cette cohorte de patients, nous avions précédemment signalé que la gravité de la maladie était associée à des réponses en anticorps neutralisants plus élevées et à des OD ELISA dans la phase aiguë de la maladie (7). L’analyse des titres d’anticorps à ≈1 an après la maladie montre que ces titres d’anticorps plus élevés continuent de persister pendant au moins 1 an. Chez les patients avec les titres d’anticorps les plus élevés, les titres d’anticorps ont diminué au cours des 6 premiers mois après l’infection, puis se sont stabilisés au cours des 6 mois suivants. Ce schéma de production d’anticorps contraste avec le schéma rapporté pour 1 patient avec un titre de microneutralisation de 400, dont les titres ont chuté à un niveau indétectable en quelques mois par le test de microneutralisation, le dosage des anticorps immunofluorescents (IFA) et l’ELISA (10).

Les patients K, L, M, N, O et P ont été désignés comme ayant une maladie non grave car ils n’ont pas reçu d’oxygénothérapie supplémentaire, même si tous, à l’exception du patient P, présentaient des signes de maladie parenchymateuse pulmonaire. Seuls 2 de ces patients (K et N) ont manifesté de fortes réponses en anticorps pendant la phase aiguë de la maladie et la convalescence précoce, et ces titres étaient toujours présents 1 an plus tard. Pour les autres patients, aucun titre d’anticorps sérologique robuste ne s’est développé pendant la phase aiguë de la maladie et les patients sont restés séronégatifs ou avec des titres d’anticorps marginaux 1 an après l’infection. En raison de la faible réponse en anticorps résultant d’une maladie symptomatique, les personnes atteintes d’une infection asymptomatique ou légère sans maladie parenchymateuse pulmonaire sévère ne devraient pas développer d’anticorps MERS-CoV détectables, une conclusion ayant des implications pour les études séroépidémiologiques.

Trois autres études ont étudié la cinétique de la persistance à long terme des anticorps chez les patients atteints de maladie MERS-CoV. Les survivants d’une épidémie de MERS-CoV en Jordanie en avril 2012 ont été suivis d’un test sérologique 13 mois et 34 mois après l’infection (11). Ces patients n’avaient pas d’infection MERS-CoV confirmée par RT-PCR, mais ils étaient probablement considérés comme ayant des infections MERS-CoV parce qu’ils avaient des résultats sérologiques positifs avec un lien épidémiologique avec un patient MERS confirmé. Sept patients avaient une maladie respiratoire aiguë aiguë symptomatique au cours de l’épidémie; parmi ceux-ci, 5 avaient des signes radiologiques de pathologie pulmonaire inférieure et 2 n’avaient pas de données d’examen radiologique thoracique. Les 7 patients avaient tous des anticorps détectables par test ELISA et IFA, et 6 d’entre eux avaient des anticorps détectables par test de microneutralisation 13 mois et 34 mois après l’infection avec des titres allant de 20 à 80. Cependant, seuls les patients avec des réponses sérologiques robustes ont été inclus dans ce (biais de sélection), et ceux sans ont été exclus par définition.

Dans une étude en Arabie saoudite, 9 patients atteints d’une infection à MERS-CoV confirmée par RT-PCR ont été suivis 3 mois, 10 mois et 18 mois (pour seulement 2 patients) après l’infection et testés par MERS-CoV S1 ELISA et IFA essai (12). Ces 9 patients (2 avec une pneumonie sévère, 3 avec une pneumonie non sévère, 1 avec des symptômes respiratoires supérieurs et 3 avec des infections asymptomatiques) ont été identifiés par la recherche des contacts. Les 5 patients atteints de pneumonie étaient positifs pour les anticorps par test ELISA et IFA 3 mois après l’infection, 4 étaient positifs par ELISA 10 mois après l’infection et 3 étaient positifs par test IFA 10 mois après l’infection. En revanche, 0 des 4 patients présentant une légère infection des voies respiratoires supérieures ou une infection asymptomatique étaient positifs par test ELISA ou IFA 3 ou 10 mois après l’infection. Ces données sont comparables aux nôtres, ce qui suggère que les infections plus bénignes sont moins susceptibles de provoquer des réponses sérologiques. Cependant, cette étude n’a pas fourni de données sur les anticorps neutralisant le virus (12). Une deuxième étude en Arabie saoudite a rapporté que seulement 4 des 11 travailleurs de la santé atteints d’une infection MERS-CoV confirmée par RT-PCR en temps réel avaient des titres d’anticorps ELISA détectables ≈1 an après l’infection; sur ces 4 travailleurs de la santé, 3 avaient des titres d’anticorps de microneutralisation détectables et seulement 1 avait un titre élevé en anticorps (800) (10).

Des titres d’anticorps décroissants ont également été mis en évidence chez des patients atteints d’un syndrome respiratoire aigu sévère – infection à CoV13). Les titres d’anticorps ont culminé à 4 mois après le début de la maladie et ont diminué à des niveaux indétectables dans 19% et 11% des échantillons de sérum par test IgG et test de microneutralisation, respectivement, 30 mois après l’infection. Le titre géométrique moyen des anticorps de microneutralisation est passé de 1232 au mois 4 à 32 au mois 30 après l’infection et est resté à ce niveau jusqu’au mois 36 (13). Chez les volontaires infectés expérimentalement par le CoV 229E humain, les titres d’anticorps neutralisants ont atteint un pic 3 semaines après l’infection et ont chuté considérablement 12 semaines après l’infection, diminuant près des niveaux de base d’un an (14). Cependant, le CoV 229E humain infecte principalement les voies respiratoires supérieures, contrairement aux agents pathogènes du syndrome respiratoire aigu sévère et du MERS, qui sont plus invasifs du parenchyme pulmonaire et se disséminent souvent de manière systémique.

La thérapie plasmatique en phase de convalescence a été proposée comme option de traitement pour les maladies respiratoires aiguës, comme le MERS, qui ne disposent pas de traitements antimicrobiens spécifiques (15,16). Nos données indiquent que le plasma avec des titres élevés d’anticorps MERS-CoV ne sera probablement disponible que chez les patients qui se sont rétablis d’une maladie grave du MERS, et ces titres diminuent sensiblement au cours des 6 premiers mois de la maladie, bien que des niveaux inférieurs d’anticorps MERS-CoV soient maintenu sur des périodes plus longues. Pour utiliser le plasma du patient en phase de convalescence pour le traitement, il sera nécessaire d’évaluer le titre d’anticorps des donneurs potentiels avant la collecte pour garantir un bon titre d’anticorps. Un test de neutralisation est probablement le test optimal pour évaluer le plasma utilisé pour la thérapie, mais parce que nos données indiquent que le S1 ELISA est bien corrélé avec les titres de neutralisation, le S1 ELISA pourrait être un test de dépistage approprié pour sélectionner des personnes pour le don de plasma.

Une limitation de ce travail est le virus utilisé pour les tests de neutralisation. Le virus du clade A MERS-CoV EMC a été utilisé pour les tests, et le virus dont les patients étaient infectés et qui a provoqué l’épidémie en Corée du Sud était un virus du clade B (le clade viral dominant circulant actuellement dans la péninsule arabique). Il a été démontré que les virus des clades A et B ne diffèrent pas antigéniquement au niveau de l’épitope de neutralisation, bien qu’ils soient génétiquement distincts (17,18). En utilisant un sous-ensemble d’échantillons de sérum de cette étude, nous avons confirmé que les titres d’anticorps neutralisants obtenus avec le virus EMC du clade A étaient similaires à ceux obtenus avec une souche de virus du clade B de l’épidémie en Corée du Sud.

En conclusion, nos résultats soutiennent et étendent la recherche des autres. Nous suggérons que les tests sérologiques pour les anticorps MERS-CoV ne peuvent identifier que certains des patients qui ont eu des infections à MERS-CoV. Les réponses sérologiques à ce virus sont variables, peu robustes et souvent indétectables lorsque la maladie est bénigne. Ainsi, les études séroépidémiologiques MERS-CoV ne détecteront qu’une fraction des infections qui surviennent dans une population et sous-estimeront probablement de manière marquée l’étendue d’une infection bénigne en cours. Nos résultats montrent également que le MERS S1 ELISA est aussi bon que les tests de neutralisation pour détecter les anticorps un an après l’infection, mais les résultats positifs d’ELISA nécessitent une confirmation avec des tests de neutralisation si les faux positifs doivent être évités dans les dosages séroépidémiologiques (M. Peiris, non publié). Les données). Le plasma en phase de convalescence peut être récolté pendant plusieurs mois à un an après la maladie chez les patients survivant à une infection au MERS-CoV, mais le plasma avec un titre élevé en anticorps n’est susceptible d’être obtenu pendant les premiers mois de convalescence que par des personnes atteintes d’une maladie grave. Étant donné que les patients pendant cette période seront probablement fragiles, cette approche sera difficile.

Le Dr Choe est chercheur clinique à l’hôpital universitaire national de Séoul. Ses intérêts de recherche portent sur la prévention des infections nosocomiales et la réponse aux maladies infectieuses émergentes.