Detection of ‘Bat coronavirus’ in India | ICMR | Coronavirus Pandemic
« K. K.-W. T., O. T.-Y. T., C. C.-Y. Y., et K.-H. C. ont également contribué à ce travail.
Kelvin Kai-Wang To, Owen Tak-Yin Tsang, Cyril Chik-Yan Yip, Kwok-Hung Chan, Tak-Chiu Wu, Jacky Man-Chun Chan, Wai-Shing Leung, Thomas Shiu-Hong Chik, Chris Yau-Chung Choi, Darshana H Kandamby, David Christopher Lung, Anthony Raymond Tam, Rosana Wing-Shan Poon, Agnes Yim-Fong Fung, Ivan Fan-Ngai Hung, Vincent Chi-Chung Cheng, Jasper Fuk-Woo Chan, Kwok-Yung Yuen, Détection cohérente du nouveau coronavirus 2019 dans la salive, Maladies infectieuses cliniques,, ciaa149, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa149
Abstrait
Le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) a été détecté dans la salive auto-collectée de 91,7% (11/12) des patients. La surveillance de la charge virale en série de la salive a généralement montré une tendance à la baisse. Le virus vivant a été détecté dans la salive par culture virale. La salive est un échantillon non invasif prometteur pour le diagnostic, la surveillance et le contrôle des infections chez les patients atteints d’une infection au 2019-nCoV.
En 2003, le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) a provoqué une épidémie mondiale dévastatrice avec un taux de létalité de 10% [1]. En décembre 2019, un coronavirus de type SARS-CoV, le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV), a fait son apparition dans la province chinoise du Hubei et s’est propagé rapidement en Chine continentale et dans d’autres parties du monde [2, 3]. Le 2019-nCoV appartient à Betacoronavirus de la lignée B du genre, et est phylogénétiquement étroitement liée aux coronavirus de type SRAS des chauves-souris [2]. Cependant, les protéines de pointe, ORF8 et ORF3b diffèrent significativement des autres coronavirus de type SRAS connus, ce qui peut conférer des différences de pathogénicité et de transmissibilité du SARS-CoV [4]. Semblable au SARS-CoV, le 2019-nCoV peut être efficacement transmis entre humains. Des cas de regroupement familial ont été rapportés [2].
La détection rapide et précise du nCoV 2019 est cruciale pour contrôler l’épidémie dans la communauté et dans les hôpitaux. Les écouvillons nasopharyngés et oropharyngés sont les types d’échantillons des voies respiratoires supérieures recommandés pour les tests de diagnostic 2019-nCoV. Cependant, la collecte de ces types d’échantillons nécessite un contact étroit entre les professionnels de santé et les patients, ce qui présente un risque de transmission du virus aux professionnels de santé. De plus, le prélèvement d’échantillons nasopharyngés ou oropharyngés provoque une gêne et peut provoquer des saignements, notamment chez les patients atteints de thrombocytopénie [2]. Par conséquent, les écouvillons nasopharyngés ou oropharyngés ne sont pas souhaitables pour la surveillance en série de la charge virale. Les expectorations sont un échantillon non invasif des voies respiratoires inférieures, mais seulement 28% des patients atteints de 2019-nCoV dans 1 série de cas pourraient produire des expectorations pour une évaluation diagnostique [3].
Des échantillons de salive peuvent être fournis facilement en demandant aux patients de cracher dans un flacon stérile. Étant donné qu’aucune procédure invasive n’est requise, la collecte de salive peut réduire considérablement les risques d’exposer les travailleurs de la santé au 2019-nCoV. Nous avons précédemment démontré que la salive a un taux de concordance élevé de plus de 90% avec les échantillons nasopharyngés dans la détection des virus respiratoires, y compris les coronavirus [5, 6]. Chez certains patients, le coronavirus n’a été détecté que dans la salive mais pas dans l’aspirateur nasopharyngé [5]. La salive a également été utilisée dans le dépistage des virus respiratoires chez les patients hospitalisés sans fièvre ni symptômes respiratoires [7]. Le SRAS-CoV peut être détecté dans la salive à des titres élevés [8].
Compte tenu des avantages des tests de salive, nous avons testé le 2019-nCoV dans la salive de patients suspects d’infection au 2019-nCoV sur la base de critères cliniques et épidémiologiques tels que définis par le Center for Health Protection de Hong Kong. Ici, nous rapportons les résultats des tests de salive.
MÉTHODES
Échantillons des patients
À Hong Kong, les tests de nCoV 2019 ont été effectués par la Direction des services de laboratoire de santé publique à Hong Kong pour les patients qui remplissaient les critères de déclaration ou les critères de surveillance renforcée [9]. Un patient est considéré comme ayant une infection confirmée en laboratoire si 2019-nCoV a été détecté dans ses échantillons nasopharyngés ou d’expectorations.
La salive a été recueillie en demandant au patient de tousser la salive de sa gorge dans un récipient stérile, et 2 ml de milieu de transport viral ont été ajoutés comme nous l’avons décrit précédemment [5, 6]. Cette étude a été approuvée par le Institutional Review Board de l’Université de Hong Kong / Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW 13-372).
Extraction d’acide nucléique et transcription inverse en temps réel – réaction en chaîne de la polymérase quantitative pour 2019-nCoV
Les échantillons de salive ont été soumis à une extraction totale d’acide nucléique par NucliSENS easyMAG (BioMérieux) comme nous l’avons décrit précédemment [5]. Chaque échantillon a été mélangé avec du tampon de lyse. Après extraction, l’acide nucléique total a été récupéré en utilisant 55 μL de tampon d’élution. Un test en interne en temps réel de réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR) en une étape et en temps réel ciblant le gène S de 2019-nCoV a été réalisé à l’aide du kit RT-PCR QuantiNova SYBR Green (Qiagen) dans un LightCycler 480 Real-Time Système PCR (Roche), comme nous l’avons décrit précédemment [2].
Culture virale
La culture virale de 2019-nCoV a été réalisée dans une installation de niveau 3 de biosécurité. Les cellules Vero E6 ont été ensemencées avec 1 ml de milieu essentiel minimum (MEM) à 2 × 10 5 cellules / ml dans des tubes de culture et incubées à 37 ° C dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant 1 à 2 jours jusqu’à confluence pour l’inoculation. Chaque échantillon de salive a été inoculé en double; 1 tube contenait de la trypsine traitée au tosylsulfonyl phénylalanyl chlorométhyl cétone (0,5 μg / mL) dans du MEM sans sérum et l’autre tube contenait du MEM avec 1% de sérum de veau foetal. Chaque tube a été inoculé avec 0,2 ml de salive et a été incubé dans une position inclinée de sorte que l’inoculum recouvre la monocouche pendant 60 minutes à 37 ° C. Ensuite, 1 ml de MEM ou de trypsine MEM a été ajouté et incubé dans un appareil à rouleaux à une vitesse de 12 à 15 tours par heure. L’effet cytopathogène induit par le virus a été examiné quotidiennement pendant 7 jours maximum.
RÉSULTATS
Un total de 12 patients atteints d’une infection 2019-nCoV confirmée en laboratoire à Hong Kong ont été inclus. L’âge médian était de 62,5 ans, allant de 37 à 75 ans. Il y avait 5 femmes et 7 hommes. Au moment de la rédaction de ce rapport, tous les patients étaient toujours hospitalisés. Les échantillons de salive ont été prélevés à une médiane de 2 jours après l’hospitalisation (intervalle, 0 à 7 jours) (figure 1). Le 2019-nCoV a été détecté dans les échantillons de salive initiaux de 11 patients (91,7%). Pour le patient K, le premier spécimen de salive prélevé le jour de l’admission à l’hôpital s’est révélé négatif. La charge virale médiane des premiers échantillons de salive disponibles était de 3,3 × 10 6 copies / mL (plage, 9,9 × 10 2 à 1,2 × 10 8 copies / mL).
Charge virale salivaire chez les patients atteints d’une nouvelle infection à coronavirus en 2019. Pour cette figure, une valeur de 10 1 a été attribuée aux échantillons dont la charge virale n’a pas été détectée.
Charge virale salivaire chez les patients atteints d’une nouvelle infection à coronavirus en 2019. Pour cette figure, une valeur de 10 1 a été attribuée aux échantillons dont la charge virale n’a pas été détectée.
Des échantillons de salive en série étaient disponibles pour 6 patients. La charge virale était la plus élevée dans les premiers échantillons disponibles pour 5 patients (83,3%). Pour le patient H, la charge virale était légèrement plus élevée le jour 1 après l’hospitalisation (6,8 × 10 7 copies / mL) que le jour de l’admission à l’hôpital (5,7 × 10 7 copies / mL).
Detection of Coronavirus in Stool of COVID 19 Patients
Pour le patient B, une excrétion virale dans la salive était toujours détectée au jour 11 après l’hospitalisation. Chez 33 patients dont les échantillons nasopharyngés étaient négatifs pour 2019-nCoV, tous les échantillons de salive étaient également négatifs. Au moment de la rédaction du présent document, les cultures virales étaient positives pour 3 patients et négatives pour 2 patients.DISCUSSION
Dans cette étude, nous avons démontré que le 2019-nCoV pouvait être détecté dans les échantillons de salive de 11 des 12 patients étudiés. Les échantillons de salive en série ont montré une baisse des niveaux d’ARN salivaire 2019-nCoV après l’hospitalisation. La culture virale a démontré que des virus vivants étaient présents dans la salive de 3 patients.
Il existe plusieurs avantages à utiliser des échantillons de salive pour le diagnostic du 2019-nCoV. Premièrement, des échantillons de salive peuvent être fournis par le patient facilement sans aucune procédure invasive. Par conséquent, l’utilisation d’échantillons de salive pourrait réduire le risque de transmission nosocomiale 2019-nCoV. Des cas d’infection à 2019-nCoV ont été découverts chez les professionnels de santé, avec au moins 1 décès rapporté [10]. Deuxièmement, l’utilisation de la salive permettra de prélever des échantillons à l’extérieur des hôpitaux où des salles d’isolement pour les infections aéroportées ne sont pas disponibles, comme dans les cliniques externes ou dans la communauté. Dans le cas où un grand nombre d’individus nécessitent un dépistage, la salive représenterait un type d’échantillon non invasif pratique. Troisièmement, étant donné que les travailleurs de la santé ne sont pas tenus de prélever des échantillons de salive, l’utilisation d’échantillons de salive éliminera le temps d’attente pour la collecte des échantillons et, par conséquent, les résultats seront disponibles beaucoup plus tôt. Ceci est particulièrement important dans les milieux cliniques occupés où le nombre de personnel disponible est limité.
Parmi les patients avec des échantillons de salive en série disponibles, il y avait une baisse générale de la charge virale pour la plupart des patients, mais 1 patient avait une excrétion virale dans la salive pendant au moins 11 jours après l’hospitalisation. L’utilisation de salive est préférée aux échantillons nasopharyngés ou oropharyngés pour la surveillance en série de la charge virale, car cela réduirait l’inconfort pour le patient et les risques pour la santé des travailleurs de la santé lors d’échantillonnages répétés. Notre expérience avec le SRAS en 2003 a montré que la charge virale atteignait souvent un pic au jour 10 après l’apparition des symptômes. Ainsi, la détection précoce et l’isolement des cas étaient stratégiques pour le contrôle des infections et offrent une fenêtre d’opportunité pour la thérapie antivirale pour diminuer la charge virale maximale.
La culture virale positive indique que la salive contient des virus vivants qui peuvent permettre la transmission. Les virus respiratoires sont considérés comme transmis de personne à personne par contact direct ou indirect, ou via des gouttelettes grossières ou fines. La salive peut être émise par la toux et des gouttelettes respiratoires contenant le virus de la grippe peuvent être trouvées même pendant une respiration normale [11]. Par conséquent, le 2019-nCoV peut être transmis par la salive directement ou indirectement, même chez les patients sans toux ni autres symptômes respiratoires. Nos résultats renforcent l’utilisation de masques chirurgicaux comme mesure de contrôle.
Il a été démontré que le SRAS-CoV infecte les cellules épithéliales dans les canaux des glandes salivaires des macaques rhésus [12]. La présence de 2019-nCoV dans la salive des patients suggère la possibilité d’une infection des glandes salivaires. Cependant, il convient de noter que les échantillons de salive contiennent non seulement de la salive sécrétée par les glandes salivaires majeures ou mineures, mais également des sécrétions provenant du nasopharynx ou remontant du poumon via l’action de cils tapissant les voies respiratoires. Des études supplémentaires sont nécessaires pour délimiter les sources de 2019-nCoV dans la salive.
Nos résultats ont démontré que la salive pouvait être un type d’échantillon non invasif pour le diagnostic et la surveillance de la charge virale du 2019-nCoV. Étant donné que la salive peut être fournie par les patients sans aucune procédure invasive, l’utilisation d’échantillons de salive réduira le risque de transmission nosocomiale de 2019-nCoV et est idéale dans les situations où la collecte d’échantillons nasopharyngés peut être contre-indiquée.
Remarques
Remerciements. Les auteurs remercient Wan-Mui Chan et Anthony Ng pour leur assistance technique.
Aide financière. Cette étude a été financée en partie par le Consultancy Service for Enhancing Laboratory Surveillance of Emerging Infectious Diseases and Research Capability on Antimicrobial Resistance for Department of Health of the Hong Kong Special Administrative Region of the People’s’s China Republic; le programme de recherche thématique (numéro de subvention T11 / 707/15) du Research Grants Council, région administrative spéciale de Hong Kong; le Sanming Project of Medicine à Shenzhen, Chine (numéro de subvention SZSM201911014); le programme de haut niveau des hôpitaux, Commission de la santé de la province du Guangdong, Chine; et les dons de Michael Seak-Kan Tong, Respiratory Viral Research Foundation Limited; Hui Ming, Hui Hoy et Chow Sin Lan Charity Fund Limited; Fondation caritative Chan Yin Chuen Memorial; Marina Man-Wai Lee; et le Hong Kong Hainan Commerical Association South China Microbiology Research Fund.
Conflits d’intérêts potentiels. Les auteurs: Aucun conflit d’intérêt signalé. Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels.
