Coronavirus: Trump coupe le financement américain de l’OMS
Lia van der Hoek
1Département de rétrovirologie humaine, Centre médical universitaire, Université d’Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas,
Klaus Sure
2Département de virologie moléculaire et médicale, Ruhr-University Bochum, Bochum, Allemagne,
Gabriele Ihorst
3Centre for Clinical Trials et Institute of Medical Biometry and Medical Informatics, University Hospital, Freiburg, Germany,
Alexander Stang
2Département de virologie moléculaire et médicale, Ruhr-University Bochum, Bochum, Allemagne,
Krzysztof Pyrc
1Département de rétrovirologie humaine, Centre médical universitaire, Université d’Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas,
Maarten F Jebbink
1Département de rétrovirologie humaine, Centre médical universitaire, Université d’Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas,
Gudula Petersen
4Wyeth Pharma, Münster, Allemagne,
Johannes Forster
5Hôpital St. Josefs, Freiburg, Allemagne
Ben Berkhout
1Département de rétrovirologie humaine, Centre médical universitaire, Université d’Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas,
Klaus Überla
2Département de virologie moléculaire et médicale, Ruhr-University Bochum, Bochum, Allemagne,
Les contributions de l’auteur: KS, GP, BB et KÜ ont conçu l’étude. KS, AS, KP, MFJ et KÜ ont effectué les expériences. LV et GI ont analysé les données. LV et BB ont contribué à la rédaction du document.
Abstrait
Contexte
La pertinence clinique des infections par le nouveau coronavirus humain NL63 (HCoV-NL63) n’a pas été étudiée systématiquement. Nous avons donc déterminé son association avec la maladie chez les jeunes enfants atteints d’une infection des voies respiratoires inférieures (LRTI).
Méthodes et résultats
Les barres représentent le pourcentage d’échantillons positifs au HCoV-NL63 par mois. Les nombres au-dessus des colonnes pour chaque mois donnent le nombre d’échantillons positifs pour HCoV-NL63 par rapport au nombre d’échantillons testés.
Tableau 1
Essais en laboratoire
Pour la PCR HCoV-NL63 en temps réel, les amorces repSZ-1 (5′- GTGATGCATATGCTAATTTG) et repSZ-3 (5′-CTCTTGCAGGTATAATCCTA) [1] ont été utilisées avec un kit RT-PCR disponible dans le commerce (QuantiTect Probe RT-PCR Kit avec ajout séparé de SYBR Green, Qiagen, Hilden, Allemagne). L’ARN (5 μl) a été transcrit en inverse dans un volume final de 20 μl pendant 20 min à 50 ° C suivi d’une dénaturation à 95 ° C pendant 15 min. Quarante-neuf cycles d’amplification par PCR ont été effectués dans un Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research, Mortlake, Australie) à 95 ° C pendant 10 s, suivis d’une étape de recuit pendant 1 min à 55 ° C. L’allongement a été effectué à 72 ° C pendant 30 s. L’accumulation de produits de PCR a été surveillée en mesurant la fluorescence du SYBR Green intercalé à 72 ° C et 81 ° C pendant 15 s. La spécificité des produits de PCR d’échantillons montrant une augmentation significative de la fluorescence du SYBR Green a été confirmée par analyse du point de fusion (pic à environ 86 ° C), en déterminant la taille du produit de PCR (237 pb) par électrophorèse sur gel d’agarose, et par hybridation à une sonde interne spécifique au HCoV-NL63 (5′-AGGGTCCTCCTGGTAGTGGTAAGTCACATTGTTCC). De plus, 17 des produits PCR positifs ont été séquencés pour confirmer davantage l’identité du produit PCR. Des précautions standard ont été prises pour empêcher la contamination croisée par PCR pendant l’extraction des échantillons et l’amplification par PCR. Les contrôles négatifs inclus dans chaque essai n’ont pas montré d’augmentation pertinente de l’intercalation SYBR Green.
Pour une évaluation quantitative, un produit de PCR de HCoV-NL63 a été cloné dans le plasmide TOPO PCR II en utilisant le kit de clonage TA d’Invitrogen (Carlsbad, Californie, États-Unis). L’ARN a été transcrit in vitro en utilisant le kit de transcription à haut rendement AmpliScribe T7 (Epicenter Technologies, Madison, Wisconsin, États-Unis) en suivant les instructions du fabricant. L’ARN synthétisé a été analysé par électrophorèse sur gel d’agarose pour l’intégrité du transcrit, et la concentration a été déterminée par la méthode Ribo-Green. Deux échantillons d’ARN transcrits indépendamment ont été ajustés à 10 9 copies / ml, et l’analyse RT-PCR des dilutions en série des deux ARN témoins a révélé que cinq copies d’ARN par réaction pouvaient être détectées. Cela correspond à une limite de détection de ≤225 copies / ml NPS. Les deux ARN témoins transcrits in vitro ont également été utilisés pour quantifier le nombre de copies d’ARN dans le surnageant d’une culture infectée par HCoV-NL63. Des dilutions en série de la préparation d’ARN de la culture virale ont été utilisées comme standards dans chaque cycle de RT-PCR en temps réel. La variabilité inter-essai des points de croisement des échantillons RT-PCR contenant entre 260 et 260 000 copies était inférieure à 2%, et la variabilité inter-essai de leur nombre de copies était inférieure à 35%. Étant donné que 260 copies d’ARN par réaction RT-PCR correspondent à une charge virale d’environ 10 4 copies d’ARN / ml de NPS, 10 4 copies / ml ont été prises comme limite inférieure pour une quantification précise.
Méthodes statistiques
Les calculs ont été effectués à l’aide du système SAS, version 8.2 (SAS Institute, Cary, Caroline du Nord, États-Unis). Les proportions ont été comparées à l’aide du test χ 2 et des comparaisons de la charge virale ont été effectuées au moyen du test à deux échantillons de Wilcoxon. Pour déterminer l’association des virus étudiés avec la maladie (croup ou non), les rapports de cotes et les intervalles de confiance à 95% correspondants ont d’abord été calculés dans des calculs bivariés séparés. Les rapports de cotes présentent la probabilité de croup chez les enfants infectés par HCoV-NL63 par rapport à la probabilité de croup chez les patients non infectés par HCoV-NL63 au sein de cette population de patients atteints de LRTI. Les résultats ont été confirmés en effectuant une régression logistique avec l’occurrence du croup comme variable dépendante et la détection du RSV, du PIV ou du HCoV-NL63 en tant que variables indépendantes. Des doubles infections ont ainsi été comptabilisées. L’INF n’a pas pu être pris en compte dans le modèle, car aucun patient atteint de croupe INF n’a été trouvé.
Résultats
Infections à HCoV-NL63
Sur les 949 échantillons PRI.DE testés, 392 provenaient de patients externes sur les quatre sites d’étude et les 557 échantillons restants provenaient de patients hospitalisés. Au total, 49 des 949 échantillons (5,2%) étaient positifs pour le HCoV-NL63. Plus d’infections par le HCoV-NL63 ont été trouvées chez les patients externes (31 patients, 7,9%) que chez les patients hospitalisés (18 patients, 3,2%, p = 0,003). Divers diagnostics cliniques de maladie des voies respiratoires inférieures ont été donnés pour les patients positifs pour le HCoV-NL63, notamment le croup, la bronchite, la bronchiolite et la pneumonie (tableau 2). L’âge des enfants infectés par le HCoV-NL63 variait de 0 à 2,9 ans, avec un âge médian de 0,7 an pour les patients hospitalisés et de 1,5 an pour les patients externes. Comme on peut s’y attendre d’après la connaissance d’autres coronavirus humains, il existe une forte distribution saisonnière du HCoV-NL63, avec une détection préférentielle entre novembre et mars (figure 1). Des pics ont été observés en décembre 2000 (14% des patients positifs) et février 2001 (12% des patients positifs). Nous n’avons trouvé aucun échantillon positif au cours des mois d’hiver de 1999 et 2000, mais les échantillons PRI.DE analysés étaient inégalement répartis et seulement 17 échantillons ont été analysés de décembre 1999 à mars 2000.
Tableau 2
HCoV-NL63 Co-Infections avec RSV-A et PIV3
Étant donné que les mêmes échantillons avaient été testés précédemment pour la présence de RSV, PIV et INF ARN [8], les échantillons positifs pour HCoV-NL63 ont été analysés pour les co-infections avec ces virus. Des co-infections étaient apparentes dans 29 des 49 échantillons positifs pour HCoV-NL63: 20 patients ont été co-infectés avec RSV-A, quatre avec RSV-B et cinq avec PIV3. Des doubles infections ont été observées chez les patients hospitalisés avec HCoV-NL63 (72%) mais également en ambulatoire (52%). La co-infection par HCoV-NL63 et RSV-A s’est produite principalement chez les patients hospitalisés (61%) plutôt que dans le groupe ambulatoire (29%). En revanche, les co-infections HCoV-NL63 avec PIV3 étaient exclusivement présentes dans le groupe ambulatoire (16%). Des tendances similaires ont également été observées lors de l’examen de la prévalence globale des virus: le RSV-A s’est produit chez 32% des patients hospitalisés contre 21% des patients externes et le PIV3 s’est produit chez 5% des patients hospitalisés et 8% des patients externes [8]. La charge en ARN de HCoV-NL63 différait considérablement de moins de 225 copies / ml (mais détectable) à 9 x 107 copies / ml aspiré. Fait intéressant, la charge de HCoV-NL63 était significativement plus élevée dans les échantillons avec des niveaux indétectables des autres ARN viraux (charge virale médiane 2,1 × 10 6 copies / ml) que dans les échantillons qui avaient des co-infections avec RSV ou PIV3 (2,7 × 10 2 copies / ml, p = 0,0006; Figure 2 ).
La charge virale médiane dans les deux groupes est indiquée (en rouge) avec le p-valeur, montrant une différence significative entre le groupe infecté par le HCoV-NL63 seul et le groupe avec une co-infection de RSV ou PIV3.
La charge du HCoV-NL63 en fonction du temps après l’infection
Comme mentionné ci-dessus, la charge de HCoV-NL63 dans le groupe infecté individuellement (n = 20) était en moyenne élevée, bien qu’il y ait eu quelques échantillons avec une charge inférieure à 10 000 copies / ml (n = 6). La charge de HCoV-NL63 peut être liée à la date d’échantillonnage par rapport au début de la maladie. Nous avons donc comparé la charge virale de ces patients avec le nombre de jours après le début de la maladie que l’échantillon a été prélevé. Pour le groupe avec une charge virale élevée (> 10 000 copies / ml), le temps médian d’échantillonnage après le début de la maladie était de 2 jours, tandis que l’intervalle médian était de 6 jours pour le groupe avec la charge virale la plus faible. Cependant, la variation du nombre de jours entre le début de la maladie et l’échantillonnage était élevée, et la différence entre le groupe à charge virale élevée et faible n’était pas statistiquement significative (p = 0.11).
Association de l’infection à HCoV-NL63 avec les symptômes cliniques
Tableau 3
En plus du croup, nous avons également observé une bronchite (n = 6, dont une avec croupe), bronchiolite (n = 3, dont l’un avait également une croupe) et une pneumonie (n = 1) chez les 14 patients avec une charge élevée en HCoV-NL63. Aucune de ces maladies n’était significativement associée à une infection unique par HCoV-NL63.
Discussion
Le coronavirus nouvellement découvert HCoV-NL63 a été détecté dans un nombre considérable d’aspirations nasales d’enfants de moins de 3 ans atteints de LRTI. Avec une occurrence globale de 5,2%, il s’agit du troisième agent pathogène le plus fréquemment détecté dans ce groupe de patients, dans lequel le VRS est détecté dans 31,4%, PIV3 dans 9,6%, PIV1 dans 2,5%, INF A ou INF B dans 2,4%, et PIV2 à 0,6%. Ces virus ont été détectés avec une fréquence similaire dans l’étude PRI.DE [8], plaidant contre un biais lors de la sélection des échantillons analysés. Le HCoV-NL63 est plus fréquemment trouvé dans le groupe ambulatoire avec LRTI (7,9%) que parmi les patients hospitalisés (3,2%). PIV3 suit le même schéma (8% et 5%, respectivement), mais le schéma inverse est observé pour RSV (21% et 32%, respectivement; [8]). Ainsi, l’infection par HCoV-NL63 semble moins pathogène que l’infection par RSV. Les patients hospitalisés positifs pour le HCoV-NL63 sont fréquemment co-infectés par le RSV. Néanmoins, plusieurs cas de maladie grave qui ont nécessité une prise en charge dans l’unité de soins intensifs étaient liés exclusivement à l’infection par le HCoV-NL63 dans cette enquête et notre précédente [1].
Le croup est une manifestation courante de LRTI chez les enfants. La cause est généralement supposée être un virus respiratoire et le PIV1 a souvent été impliqué [12]. Parmi les 69 échantillons de patients analysés avec le croup, le croup était en effet fréquemment lié au PIV1 (14,5%), mais au PIV3 (15,9%), au RSV-A (13,0%), au PIV2 (7,2%) et au RSV-B (1,4% ) ont également été détectés dans un pourcentage considérable d’échantillons. Le HCoV-NL63 a pu être détecté chez 17,4% de ces patients atteints de croupe et était donc le virus respiratoire le plus fréquemment identifié pour le croup. Étant donné que la plupart des échantillons testés provenaient de l’année 2000-2001, nous ne pouvons pas exclure que le pourcentage élevé d’échantillons positifs pour le HCoV-NL63 soit dû à une forte activité virale au cours de cette année particulière, et des études à long terme sont nécessaires pour déterminer information indiquant si les infections à HCoV-NL63 surviennent au cours de cycles atteignant un pic tous les deux à trois ans, comme observé pour d’autres virus respiratoires.
On a signalé que le croup se produisait principalement chez les garçons, et il montre une occurrence maximale dans la deuxième année de vie et principalement à la fin de l’automne ou au début de la saison d’hiver [12]. L’infection au HCoV-NL63 semble suivre ces tendances: le ratio garçons infectés / filles infectées est de 10: 4, l’âge médian dans le groupe ambulatoire avec HCoV-NL63 est de 1,55 an et ce virus circule principalement pendant les mois d’hiver. Ainsi, il sera intéressant d’étudier les raisons biologiques sous-jacentes de la sensibilité accrue des jeunes garçons au HCoV-NL63, car cela peut également expliquer le nombre plus élevé de patients masculins atteints de croup. Une occurrence préférentielle chez les garçons a été décrite pour d’autres maladies respiratoires dont l’asthme [13], et les infections par coronavirus humain ont été précédemment associées à des exacerbations de l’asthme [14]. Il sera donc également intéressant d’étudier ce lien pour HCoV-NL63.
Les résultats de l’étude PRI.DE indiquent que les co-infections avec plusieurs virus respiratoires sont rares (1,5% de tous les échantillons testés; [8]).
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En revanche, nous rapportons la détection de plus d’un ARN viral dans 59% des échantillons positifs pour HCoV-NL63, ce qui représente 3% des 949 échantillons testés. La plupart des co-infections sont dues au RSV-A, probablement en raison du pourcentage élevé d’infections au RSV-A et d’un chevauchement saisonnier. Pendant la saison d’hiver, le pourcentage d’échantillons positifs pour le RSV par mois peut dépasser 50% et même la différence globale de pourcentage d’échantillons positifs pour le RSV parmi les échantillons négatifs et positifs pour le HCoV-NL63 n’était pas significative (test exact de Fisher, bilatéral) ). Cela contraste avec les résultats obtenus pour les patients PIV1 et PIV3 positifs, pour lesquels une co-infection par le VRS est rarement observée (données non présentées). Par conséquent, l’infection par RSV semble réduire l’infection par PIV1 et PIV3 (ou vice versa), mais pas l’infection par HCoV-NL63 (ou vice versa).Une analyse PCR quantitative pour HCoV-NL63 a révélé une charge virale HCoV-NL63 significativement plus faible chez les patients co-infectés par RSV ou PIV3 que chez les patients infectés par HCoV-NL63 seul. Cet effet d’interférence pourrait s’expliquer par une compétition directe pour la même cellule cible dans les organes respiratoires ou un statut d’activation élevé des réponses immunitaires innées. La persistance prolongée du HCoV-NL63 à de faibles niveaux est une autre explication. La charge de HCoV-NL63 variait en fonction du moment de l’échantillonnage par rapport au moment du début de la maladie, avec les charges virales plus élevées dans les échantillons précoces (jour 1 ou 2 après le début de la maladie). Cela reflète probablement la clairance virale du système immunitaire. Cet effet de synchronisation peut également être lié aux différences de charge de HCoV-NL63 dans les infections simples par rapport aux infections doubles. Par exemple, une infection initiale au HCoV-NL63 peut préparer le terrain pour une infection subséquente au RSV. Au moment où ce deuxième virus provoque des symptômes et que des échantillons de NPS sont prélevés, l’infection à HCoV-NL63 peut déjà être sous contrôle par le système immunitaire.
L’étude initiale sur le HCoV-NL63 chez des patients d’Amsterdam atteints de maladies des voies respiratoires a répertorié 20% de co-infections, ce qui est nettement inférieur aux 59% que nous rapportons dans la présente étude. Des différences dans la manipulation des échantillons cliniques peuvent en partie expliquer cela. Des échantillons de NPS ont été prélevés de manière standardisée et immédiatement congelés dans de l’azote liquide dans l’étude PRI.DE. L’extraction d’acide nucléique a été effectuée immédiatement après décongélation. Un tel échantillonnage optimal et une manipulation ultérieure peuvent permettre la détection de charges de HCoV-NL63 plus faibles (comme observé principalement dans les co-infections). En revanche, les échantillons d’Amsterdam ont été congelés et décongelés à plusieurs reprises avant l’isolement d’acide nucléique, ce qui peut avoir rendu les échantillons à faible charge négatifs. Cela peut également expliquer la proportion plus élevée de HCoV-NL63 positifs mesurés dans la présente étude (5,2% contre 1,4%). Alternativement, le HCoV-NL63 pourrait suivre des périodes d’activité accrue comme les autres virus respiratoires et culminer tous les 2 à 3 ans, et l’incidence de 5,2% en 2000-2001 pourrait représenter une telle année de pointe.
En conclusion, notre étude a révélé que le HCoV-NL63 appartient au groupe des virus les plus fréquemment détectés chez les enfants de moins de 3 ans atteints de LRTI et que ce virus est fortement associé au croup. Des articles récents sur HCoV-NL63 montrent que ce virus se propage dans le monde entier [15–19]. Le virus a été détecté dans différentes parties du monde: Australie, Canada, Japon, Belgique et États-Unis. Ainsi, le HCoV-NL63 est un virus respiratoire humain qui devrait être ajouté à la liste des agents pathogènes pouvant causer de nombreux LRTI chez les jeunes enfants.
Résumé du patient
Contexte
Les infections des voies respiratoires inférieures (qui ne sont pas uniquement des toux et des rhumes) sont très fréquentes chez les jeunes enfants et peuvent être graves. La plupart des infections sont causées par des virus, dont les plus connus sont le virus respiratoire syncytial (RSV) et le virus de la grippe (INF).
Pourquoi cette étude a-t-elle été réalisée?
Récemment, un nouveau virus appelé HCoV-NL63 a été découvert, qui est un coronavirus humain (le SRAS est un autre coronavirus). Des travaux antérieurs ont montré que ce virus était présent chez un enfant atteint de bronchiolite. Les chercheurs ont voulu savoir si le virus était associé à d’autres maladies respiratoires.
Qu’est-ce que les chercheurs ont fait et trouvé?
Ils ont examiné 949 échantillons prélevés sur des enfants atteints d’infections des voies respiratoires inférieures en Allemagne entre 1999 et 2001. Ils ont constaté que le virus HCoV-NL63 était plus fréquent chez les patients externes que chez les patients hospitalisés, et que plus de 40% des enfants infectés par ce virus seulement avaient une croupe. contre environ 6% des enfants qui ne sont pas porteurs du virus.
Que signifient ces résultats?
Bien que le nombre de tous les enfants infectés par ce nouveau virus ne soit pas élevé, ces résultats suggèrent que ce virus est une cause de croupe chez certains enfants et pourrait être la troisième cause la plus fréquente d’infections des voies respiratoires inférieures dans ce groupe. Plus de travail doit être fait pour voir si cela est vrai dans d’autres années et dans d’autres pays.
Où puis-je obtenir plus d’informations en ligne?
MedlinePlus a des pages Web sur croup:
La clinique Mayo a des informations sur le croup pour les parents:
Remerciements
Un soutien financier a été reçu de Wyeth Pharma, Münster, Allemagne. Le Centre for Clinical Trials reçoit un financement du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Abréviations
| HCoV-NL63 | coronavirus humain NL63 |
| INF | virus de la grippe |
| LRTI | infection des voies respiratoires inférieures |
| NPS | sécrétion nasopharyngée |
| PIV | virus parainfluenza |
| FIERTÉ | Infection respiratoire pédiatrique en Allemagne |
| RSV | virus respiratoire syncytial |
Notes de bas de page
Référence: van der Hoek L, Sure K, Ihorst G, Stang A, Pyrc K, et al. (2005) Croup est associé au nouveau coronavirus NL63. PLoS Med 2 (8): e240.
