Réactivité croisée antigénique entre le syndrome respiratoire aigu sévère – Coronavirus associé et coronavirus humains 229E et OC43

Four Questions To Get You Through Corona Virus

Xiao-yan Che, Li-wen Qiu, Zhi-yong Liao, Ya-di Wang, Kun Wen, Yu-xian Pan, Wei Hao, Ya-bo Mei, Vincent CC Cheng, Kwok-yung Yuen, Antigenic Cross-Reactivity entre Syndrome respiratoire aigu sévère – Coronavirus associé et coronavirus humains 229E et OC43, Le Journal des maladies infectieuses, Volume 191, numéro 12, 15 juin 2005, pages 2033-2037, https://doi.org/10.1086/430355

Abstrait

La réactivité croisée entre les anticorps dirigés contre différents coronavirus humains (HCoV) n’a pas été systématiquement étudiée. En utilisant l’analyse par Western blot, le test d’immunofluorescence indirecte (IFA) et le test d’immunosorbant enzymatique (ELISA), la réactivité croisée antigénique entre le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) – coronavirus associé (SARS-CoV) et 2 HCoV (229E et OC43) a été démontrée chez des animaux immunisés et du sérum humain. Chez 5 des 11 et 10 des 11 patients atteints du SRAS, les échantillons de sérum appariés ont montré une augmentation de 4 fois le titre des anticorps contre HCoV-229E et HCoV-OC43, respectivement, par l’IFA. Dans l’ensemble, les échantillons de sérum de patients convalescents atteints du SRAS avaient une réactivité croisée unidirectionnelle avec les 2 HCoV connus. Les antigènes du SARS-CoV et du HCoV-OC43 étaient plus réactifs que ceux du SARS-CoV et du HCoV-229E.

Le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) est une maladie infectieuse émergente causée par un nouveau coronavirus (CoV) appelé «CoV associé au SRAS» (SARS-CoV) [1]. Trois groupes antigéniques connus de CoV sont associés à des maladies chez les animaux et les humains [2]. Les CoV humains connus (HCoV) – HCoV-229E, dans le groupe CoV 1, et HCoV-OC43, dans le groupe CoV 2 – sont généralement reconnus pour causer des maladies bénignes des voies respiratoires supérieures et, rarement, des maladies des voies respiratoires inférieures [2]. Les analyses phylogénétiques montrent que le SARS-CoV n’est étroitement lié à aucun des CoV précédemment caractérisés [3]. Cependant, certains chercheurs, utilisant des cellules Vero infectées par le SRAS-CoV dans des tests d’immunohistochimie, ont observé des réactions croisées entre le SRAS-CoV et les CoV du groupe I, mais des études séroépidémiologiques ont révélé qu’il n’y avait aucune réaction croisée avec Vero infecté par le SRAS-CoV cellules dans 13 et 14 échantillons de sérum appariés de patients atteints de HCoV-OC43 et HCoV-229E, respectivement [1]. Des échantillons de sérum d’animaux infectés par le CoV du groupe I ont également réagi de façon croisée avec la protéine nucléocapside recombinante du SARS-CoV [4]. Les résultats de l’ELISA basé sur la protéine nucléocapside recombinante étaient positifs dans 1,04% des échantillons de sérum provenant de donneurs de sang sains [5]. La nature de cette réactivité croisée antigénique est encore inconnue. Dans la présente étude, nous avons cloné les gènes nucléocapside de SARS-CoV, HCoV-229E et HCoV-OC43 et produit des antisérums animaux spécifiques pour déterminer si la protéine nucléocapside est responsable de la réactivité croisée antigénique observée. De plus, les relations antigéniques entre le SRAS-CoV, le HCoV-229E et le HCoV-OC43 ont été étudiées plus avant à l’aide d’échantillons de sérum provenant de donneurs sains et de patients atteints du SRAS.

Sujets, matériaux et méthodes. Les souches HCoV 229E (ATCC VR740) et OC43 (ATCC VR759) ont été maintenues dans des cellules de fibroblastes pulmonaires fœtaux humains normaux (MRC-5; ATCC CCL-171) et des cellules rénales de singe vert d’Afrique (BSC-1; ATCC CCL-26) dans MEM (Gibco BRL) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (Gibco BRL). Une souche SARS-CoV (HKU-39849) isolée d’un patient atteint du SRAS à Hong Kong a été inoculée dans des cellules Vero E6 comme décrit ailleurs [6, 7]. Toutes les expériences avec des virus vivants ont été réalisées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 3.

Des anticorps monoclonaux murins spécifiques des protéines nucléocapside de HCoV-229E et HCoV-OC43 ont été obtenus auprès d’une source commerciale (Chemicon International). Des anticorps antimonoclonaux spécifiques de la protéine nucléocapside de SARSCoV ont été produits dans notre laboratoire [8]. Un antisérum contre le virus entier a été préparé chez des lapines blanches de Nouvelle-Zélande, comme décrit ailleurs [9].

Les fragments d’ADNc de la protéine nucléocapside des 3 CoV ont été clones dans le vecteur d’expression procaryote pQE30 (Qiagen) dans le cadre et en amont de la série des 6 résidus histidine (His6), et le His₆-les protéines nucléocapside marquées ont été exprimées et purifiées en utilisant une colonne d’affinité Ni-NTA (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. Les protéines nucléocapside recombinantes exprimées ont été identifiées par analyse Western blot comme décrit ailleurs [8].

Les IgG spécifiques du SRAS-CoV ont été identifiées à l’aide d’un kit d’essai d’immunofluorescence indirecte (IFA) disponible dans le commerce (Euroimmun) conformément aux instructions du fabricant. Des IgG spécifiques au HCoV-229E – et au HCoV-OC43 – ont été identifiées par un IFA interne, comme décrit ailleurs [7], qui a été modifié pour utiliser des cellules MRC-5 infectées par le HCoV-229E et des cellules BSC-1 infectées par le HCoV-OC43 – infectées, respectivement.

Les anticorps IgM et IgG dirigés contre le SRAS-CoV ont été identifiés à l’aide d’un kit de test ELISA (Huada GBI Biotechnology) conformément aux instructions du fabricant. L’ELISA à base de protéine nucléocapside a été réalisée comme décrit ailleurs [6]. Pour assurer la biosécurité, des expériences utilisant des échantillons de sérum de patients ont été réalisées dans un laboratoire de niveau 2 de biosécurité.

Une centaine d’échantillons de sérum ont été prélevés au hasard sur des donneurs adultes en bonne santé en octobre 2003. Des échantillons de sérum ont été prélevés sur 34 patients atteints du SRAS 8 à 81 jours après le début des symptômes. Des échantillons de sérum appariés ont été obtenus auprès de 11 de ces patients présentant une séroconversion (tableau 1), auprès desquels les échantillons de sérum en phase aiguë et convalescente ont été prélevés les jours 1 à 7 et les jours 12 à 159 après le début des symptômes. Le SRAS a été diagnostiqué conformément aux critères de l’Organisation mondiale de la santé et a été confirmé par l’évaluation de la séroconversion ou d’une augmentation de 4 fois le titre des anticorps contre le SRAS-CoV par l’IFA.

Résultats. Les longueurs complètes de 3 gènes de nucléocapside de HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV ont été amplifiées avec leurs paires d’amorces correspondantes. Les tailles des gènes étaient de 1182, 1359 et 1281 pb pour HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARSCoV, respectivement. Les plasmides recombinants ont été séquences, et ils étaient tous dans le cadre et avaient des séquences correspondant à celles des gènes de nucléocapside des 3 CoV. Le His recombinant exprimé₆des protéines nucléocapside N-terminales marquées ont été identifiées par analyse Western blot en utilisant des anticorps monoclonaux anti-His. Les bandes de protéines immunoréactives avec les tailles attendues sont représentées sur la figure 1A. Les protéines nucléocapside de HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV ont réagi fortement et spécifiquement avec le sérum de lapin immunisé contre la protéine nucléocapside correspondante sous forme de bandes de protéines immunoréactives sur le Western blot (figure 1B). Aucune réactivité croisée n’a été démontrée entre les protéines nucléocapside de HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV. Ces résultats indiquent qu’aucune réactivité croisée antigénique substantielle ne s’est produite parmi les protéines nucléocapside de HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV lorsque le sérum de lapin immun a été utilisé.

Le sérum de lapin immunisé contre le SRAS-CoV a réagi très fortement avec les cellules infectées par le SARS-CoV, modérément avec les cellules infectées par le HCoV-229E et faiblement avec les cellules infectées par le HCoV-OC43 par l’IFA. Inversement, le sérum de lapin immunisé contre HCoV-229E a réagi très fortement avec les cellules infectées par HCoV-229E mais n’a pas réagi avec les cellules infectées par le SRAS-CoV ou HCoV-OC43. Le sérum immun de lapin HCoV-OC43 — réagit très fortement avec les cellules infectées par HCoV-OC43 — et fortement avec les cellules infectées par HCoV-229E mais ne réagit pas avec les cellules infectées par le SRAS-CoV. De plus, le sérum de lapin immunisé contre le SRAS-CoV et le HCoV-OC43 a montré de faibles signaux fluorescents provenant des cellules MRC-5 et BSC-1 non infectées, par rapport à la réponse dans le sérum de lapin non immun.

Pour déterminer la réponse sérologique aux protéines nucléocapsides des 3 CoV, 100 échantillons de sérum prélevés sur des donneurs sains et 34 échantillons de sérum prélevés sur des patients atteints du SRAS ont été testés avec des protéines nucléocapsides recombinantes de HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV à l’aide d’un Analyse Western blot. Les échantillons de sérum provenant de donneurs sains ont montré une forte réactivité aux protéines nucléocapside de HCoV-229E et HCoV-OC43, avec des résultats positifs dans 97% et 99% des échantillons, respectivement. Seuls 2 échantillons (2%) ont réagi avec la protéine nucléocapside SARS-CoV. En revanche, les échantillons de sérum de patients atteints du SRAS obtenus 8 à 81 jours après le début des symptômes ont montré une forte immunoréactivité aux protéines nucléocapside de HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV, avec des résultats positifs dans 97%, 100% des cas. et 100% des échantillons, respectivement.

Lorsque des cellules infectées au CoV ont été utilisées, les résultats étaient positifs pour les anticorps IgG par IFA dans 98% (HCoV-229E), 100% (HCoV-OC43) et 1% (SARS-CoV) des échantillons de sérum provenant de donneurs sains. Deux échantillons provenant de donneurs sains n’avaient aucune réponse en anticorps contre HCoV-229E par IFA et aucune réponse en anticorps contre la protéine nucléocapside de HCoV-229E par analyse Western blot. Un échantillon prélevé en octobre 2003 avait une réponse en anticorps au SARS-CoV par l’IFA et à la protéine nucléocapside du SARS-CoV par analyse Western blot. Cependant, 100% des échantillons de 34 patients atteints du SRAS avaient des réponses d’anticorps au HCoV-229E, au HCoV-OC43 et au SARS-CoV. Chez des donneurs sains, les résultats de l’IFA ont montré la présence d’anticorps en réponse aux protéines nucléocapside de HCoV-229E et HCoV-OC43 en association avec la présence d’anticorps IgG dirigés contre les deux HCoV, mais les anticorps dirigés contre le SRAS-CoV étaient absents dans tous échantillons sauf 1, qui avait un titre d’anticorps faible de 1:10, par rapport au titre d’anticorps habituel d’au moins 1: 100 chez la plupart des patients atteints du SRAS. Les échantillons de sérum de patients atteints du SRAS avaient des réponses en anticorps au SARS-CoV ainsi qu’au HCoV-229E et au HCoV-OC43 lorsque des protéines de nucléocapside étaient utilisées dans l’analyse Western blot et lorsque des cellules infectées par le CoV étaient utilisées dans l’IFA.

Des échantillons de sérum appariés de 11 patients atteints du SRAS ont été utilisés pour déterminer les relations antigéniques entre les 3 CoV par IFA et ELISA. Les titres d’anticorps dirigés contre HCoV-229E, HCoV-OC43 et SARS-CoV sont présentés dans le tableau 1. Pour déterminer quel antigène viral était responsable des réactions croisées, le filtrat de culture de cellules infectées par HCoV-229E et HCoV-OC43 a été immunotransféré avec les échantillons de sérum appariés. Une bande forte à ∼44 kDa, le même poids moléculaire auquel il y a eu une réaction avec un anticorps monoclonal spécifique contre la protéine nucléocapside du HCoV-229E, a été observée dans les échantillons en phase de convalescence de 2 patients atteints du SRAS (figure 1C).

Les coronavirus sont une grande famille de virus, certains provoquant des maladies respiratoires

Ces échantillons de sérum présentaient également des titres d’anticorps plus élevés dans le test ELISA basé sur la protéine nucléocapside HCoV-229E. Les échantillons de sérum appariés des 9 autres patients avaient également une bande réactive faible ou modérée à -44 kDa lorsqu’ils ont été immunotransférés avec HCoV-229E. Le sérum en phase aiguë ou en phase de convalescence provenant de 11 échantillons de sérum appariés avait une faible bande réactive à ∼50 kDa, le même poids moléculaire auquel il y avait une réaction avec un anticorps monoclonal spécifique contre la protéine nucléocapside de HCoV-OC43 lorsqu’elle était immunotransférée avec HCoV-OC43 (données non représentées).

Discussion. Nos résultats indiquent qu’aucune réactivité croisée antigénique de la protéine nucléocapside n’a été trouvée entre le SRAS-CoV et le sérum de lapin immunisé contre le HCoV-229E ou le HCoV-OC43. Dans nos études précédentes, aucun anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique contre la protéine nucléocapside du SRAS-CoV n’a réagi de manière croisée avec HCoV-229E ou HCoV-OC43 [8, 10]. Cependant, une étude précédente a décrit la réactivité croisée entre les protéines nucléocapside du SRAS-CoV et celles des CoV du groupe I [4]. Cette réactivité croisée peut dépendre du type de sérum utilisé. Un autre chercheur a démontré que le HCoV-229E – sérum animal immunisé réagissait de façon croisée avec le SRAS-CoV [1]. Dans la présente étude, lorsque nous avons utilisé une coloration immunofluorescente de cellules infectées par le CoV, le sérum de lapin immunisé par le HCoV-229E et le HCoV-OC43 n’a pas réagi de façon croisée avec les cellules infectées par le SRAS-CoV, tandis que le sérum de lapin immunisé par le SARS avait réactivité croisée modérée avec les cellules infectées par le HCoV-229E et faible réactivité croisée avec les cellules infectées par le HCoV-OC43. Bien que le sérum de lapin immunisé contre le SRAS-CoV qui avait des titres élevés en anticorps contre le SRAS-CoV ait été légèrement contaminé par des anticorps dirigés contre les composants des cellules hôtes, il est évident que le sérum avait une réactivité croisée avec le HCoV-229E et le HCoV-OC43. De plus, l’IFA a montré que HCoV-OC43 – sérum de lapin immun avait une forte réactivité croisée avec HCoV-229E. Cette réactivité croisée a été observée par certains chercheurs [11, 12] mais pas par d’autres [13, 14]. Il est possible que certains anticorps du sérum de lapin aient réagi contre les cellules hôtes ou aient réagi de façon croisée avec HCoV-229E.

Étant donné que les 2 HCoV connus sont responsables de ∼30% de tous les rhumes courants [2], il n’est pas surprenant que 97% et 99% des échantillons de sérum provenant de donneurs sains contenaient des anticorps anti-HCoV-229E et HCoV-OC43, respectivement. Par conséquent, il est prévu que les anticorps anti-HCoV-229E et HCoV-OC43 trouvés dans les échantillons de sérum de patients atteints du SRAS préexistaient ou étaient des anticorps à réaction croisée contre HCoV-229E et HCoV-OC43. D’autres études sur cette question sont justifiées. L’IFA a montré que les échantillons de sérum appariés présentaient une augmentation d’environ 4 fois des titres d’anticorps contre HCoV-229E et HCoV-OC43 chez 5 des 11 et 10 des 11 patients atteints du SRAS, respectivement. Une telle réponse élevée du titre d’anticorps aux HCoV connus chez les patients atteints du SRAS peut représenter une réaction anamnestique à des infections précédentes avec les 2 HCoV connus ou d’autres CoV ou une réaction croisée entre SARS-CoV et HCoV-229E ou HCoV-OC43. Cependant, l’ELISA basé sur la protéine nucléocapside a détecté une augmentation des titres d’anticorps dans seulement 2 des 11 échantillons de sérum appariés de patients atteints du SRAS lorsque la protéine nucléocapside du HCoV-229E a été utilisée comme antigène, et ils ont eu une réaction de signal augmentée de manière constante à la nucléocapside protéine de HCoV-229E – filtrat de culture cellulaire infecté par analyse Western blot (figure 1C). Les échantillons de sérum appariés provenant de patients atteints du SRAS n’ont montré aucune augmentation constante des titres d’anticorps dans le test ELISA basé sur la protéine nucléocapside HCoV-OC43 et aucune augmentation de la réaction de signal à la protéine nucléocapside du HCoV-OC43-filtrat de culture cellulaire infecté par analyse Western blot. Ces résultats confirment la suggestion selon laquelle la réactivité croisée antigénique majeure avec le HCoV-OC43 dans les échantillons de sérum en phase convalescente des patients atteints du SRAS n’est pas due aux protéines nucléocapsides mais à d’autres composants viraux. Bien que les échantillons de sérum appariés provenant de patients atteints du SRAS aient montré une réaction croisée partielle au HCoV-229E, il n’y avait pas de corrélation étroite significative entre les ratios de titre IFA, qui ont été déterminés en réponse à des cellules infectées par le virus entier, et les ratios de titre ELISA, qui ont été déterminées en réponse aux protéines nucléocapside. De plus, des anticorps dirigés contre le SRAS-CoV n’ont pu être détectés que dans un échantillon de sérum provenant d’un donneur sain par IFA ou par analyse Western blot basée sur les protéines nucléocapsides, même si les patients atteints du SRAS avaient des anticorps anti-HCoV-229E et HCoV-OC43. Par conséquent, il n’y a pas de réactivité croisée sérologique avec le SRAS-CoV chez des donneurs sains même s’ils ont une réactivité élevée aux HCoV [15].

En résumé, le SRAS-CoV avait une réactivité croisée antigénique unidirectionnelle apparente avec les 2 HCoV connus. Bien qu’il ne soit pas clair quels déterminants antigéniques étaient impliqués, les résultats globaux suggèrent que SARS-CoV et HCoV-OC43 sont plus étroitement liés antigéniquement que SARS-CoV et HCoV-229E. Des études utilisant un certain nombre de composants viraux recombinants purifiés de CoV comme antigènes pour identifier les anticorps produits pendant l’infection et pour déterminer les relations antigéniques entre CoV sont en cours.

Remerciements

Nous remercions Biao Di (Centers for Disease Control and Prevention of Guangzhou, République populaire de Chine), pour avoir fourni les données sérologiques des patients atteints de syndrome respiratoire aigu sévère pour analyse, et San Francisco Edit, pour l’aide à la rédaction du manuscrit.